Real-time motion and orientation tracking of single nanoparticles in neurons
Suivi en temps réel du mouvement et de l'orientation de nanoparticules individuelles dans des cellules neuronales
Résumé
This manuscript presents the work carried out during my three years of doctoral studies at the LuMIn laboratory, where I participated in the development of the 5D-RedShot microscopy setup. The aim of this device is to study the dynamics of intracellular endosome movement in neurons. Anomalies in these movements are already known to be associated with neurodegenerative diseases, but they are still poorly studied quantitatively.During my thesis, I improved a pre-existing setup that superlocalizes single nanocrystals by exciting them in the infrared and then detecting their second harmonic generation. The use of a DMD (Digital Micromirror Device) ensures the displacement of the excitation beam through holography, while correcting static optical aberrations. It then becomes possible to track movements in 3D over several tens of micrometers at high temporal resolution (several hundred Hz). The localization precision reaches a few nanometers in the sample plane and about ten nanometers along the optical axis. Several types of nanoparticles were tested and compared based on their emission properties and size.A notable improvement in the setup was the measurement of the orientation of the nanocrystals, simultaneous with their position. Access to this information now allows for the measurement of five parameters of the trajectory: three positions and two angles, without degrading previous performance.The tracking of trajectories in cultured neurons revealed typical characteristics of intraneuronal movement and paves the way for the use of this microscopy technique in complex samples.
Ce manuscrit présente le travail effectué durant mes trois années de doctorat au laboratoire LuMIn où j'ai participé au développement du montage de microscopie 5D-RedShot. L'objectif de ce dispositif est l'étude de la dynamique des mouvements intracellulaires d'endosomes dans des neurones. Des anomalies de ces mouvements sont déjà connues pour être liées à des maladies neurodégénératives, mais sont encore peu étudiées quantitativement.Durant ma thèse, j'ai perfectionné un montage pré-existant qui superlocalise des nanocristaux uniques, en les excitant dans l'infra-rouge puis en détectant leur génération de second harmonique. L'utilisation d'un DMD (Digital Micromirror Device) assure le déplacement du faisceau d'excitation par holographie, tout en corrigeant les aberrations optiques statiques.Il devient alors possible de suivre des mouvements en 3D, sur plusieurs dizaines de micromètres, à haute cadence temporelle (plusieurs centaines de Hz). La précision de localisation atteint quelques nm dans le plan de l'échantillon, et une dizaine de nm le long de l'axe optique.Plusieurs types de nanoparticules ont été testés et comparés selon leurs propriétés d'émission et de taille.Une amélioration notable du montage a été la mise en œuvre de la mesure de l'orientation des nanocristaux, simultanée à celle de leur position.L'accès à cette information permet désormais de mesurer cinq paramètres de la trajectoire : trois positions et deux angles, sans dégrader les performances précédentes.Le suivi de trajectoires dans des neurones en culture a montré des caractéristiques typiques de mouvement intraneuronal et ouvre la voie à l'utilisation de cette technique de microscopie dans des échantillons complexes.
| Origine | Version validée par le jury (STAR) |
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